題目：不同年齡軟骨ECM對BMSC體外和體內軟骨生成的影響

（如果需要完整文獻請與我們工作人員聯系，可試樣）

1. 簡介

基于細胞外基質（ECM）的生物材料通過模擬天然微環境來調節沒有外源性生長因子的骨髓間充質干細胞（BMSC）的軟骨分化，是軟骨組織工程的有希望的候選者。ECM支架的生物學特性主要取決于原始來源，這將直接影響ECM材料的軟骨作用。盡管近年來對ECM支架的研究不斷擴大，但優化的ECM材料在軟骨再生中的選擇較少報道。在這項研究中，我們收獲并比較了新生兒、幼年和成年兔的關節軟骨ECM。結果表明，不同年齡ECM在脫細胞前后的機械強度、硫酸化糖胺聚糖和膠原蛋白含量存在顯著差異。因此，三種基于ECM的膠原蛋白水凝膠顯示出不同的組成和機械性能，它們發揮了年齡依賴性軟骨誘導性。總的來說，體外和體內結果表明，新生兒ECM促進BMSCs的軟骨形成最多，但導致嚴重的基質鈣化。相比之下，BMSCs通過成人ECM合成了最少量的軟骨基質，鈣化最小。幼年ECM在促進BMSC軟骨生成和預防基質鈣化方面取得了總體效果。總之，這項研究為我們目前在設計未來基于ECM的生物材料以成功修復關節軟骨方面的知識提供了重要信息。

2.材料和方法

機械評估

使用納米壓頭確定每個樣品的力學評估（Piuma，Optics11，荷蘭）。有效楊氏模量通過數據擬合以下參數計算得出： 探頭剛度 4.3 （N m?1);半徑 51.0 μm。

機械測試

使用動態機械分析儀，在室溫下測定膠原蛋白水凝膠和三種不同膠原蛋白-DCP復合水凝膠（Φ 8 mm×h 2.5 mm）的儲存和損耗模量，并在多頻模式（1-5 Hz）下測量其機械性能。

不同年齡兔天然軟骨組織的比較

含水量和機械強度

首先比較了新生、幼年或成年兔的原生軟骨組織的差異。3日齡兔軟骨組織中的含水量（圖1A）顯著高于其他兩個樣品。100天和200天之間的含水量沒有顯著差異。有效楊氏模量測定的力學性能表明，軟骨組織的機械強度隨年齡的增長而增加，各組間差異均有統計學意義。

圖1

表征來自新生兒、幼年或成年兔的天然軟骨組織。（A）含水量（左）和機械強度（中）。（B）DNA，sGAG和總膠原蛋白含量（n = 3）。ns 表示 P > 0.05，* 表示 P < 0.05，** 表示 P < 0.01，*** 表示 P < 0.001。

DNA、sGAG 和總膠原蛋白的定量

通過定量DNA含量來評估新生、幼年或成年兔軟骨組織中的細胞密度（圖1B），其隨著年齡的增長呈下降趨勢。3天樣本的DNA含量明顯較高，為14 371 ng/mg±480 ng/mg，是其他兩個樣本的四倍多。100天樣品中的DNA含量為3325 ±220 ng/mg，高于200天樣品中的2588 ±410 ng/mg，但這種差異沒有統計學意義。3個不同組的sGAG含量遵循相同的DNA趨勢，在3天、100天和200天樣品中分別為184.17±12.30、117.87±2.97和110.57±2.61 μg/mg。3 天樣本中的 sGAG 值在統計學上高于其他兩個樣本，但 100 天和 200 天樣本之間的差異沒有統計學意義。相比之下，3組總膠原蛋白含量的DNA和sGAG值呈逆轉趨勢，其中200天樣品的最高值為855.51±38.14 μg/mg，其次是100天樣品中的753.53 ±27.69 μg/mg和3 d樣品中的629.10 ± 19.68 μg/mg。值得注意的是，所有組間總膠原蛋白含量的差異具有統計學意義。

機械性能和降解

通過儲能模量（圖3B）和損耗模量（圖3C）表征了水凝膠的力學性能，它們分別代表了水凝膠的彈性和粘度。一般來說，膠原蛋白水凝膠的儲存量和損耗模量，并且隨著DCP的摻入而增加。此外，隨著老兔的DCPs的加入，復合水凝膠的存儲模量和損耗模量均進一步增加。結果，四種水凝膠的總儲存和損耗模量遵循膠原蛋白-200d>膠原蛋白-100d>膠原蛋白-3d>膠原蛋白的順序。4種水凝膠在膠原酶溶液中的降解速率如圖.3D所示。一般來說，膠原蛋白水凝膠具有較高的降解速率，在19 h內降解。相比之下，3種膠原蛋白-DCP復合水凝膠的降解曲線相似，24 h時膠原蛋白-3d、膠原蛋白-100d和膠原蛋白-200d水凝膠的降解率分別為95.56%、92.20%和93.07%。

討論

當使用天然軟骨組織作為原材料來制造ECM支架時，了解軟骨組織的內在特性非常重要，因為這可以為進一步優化ECM材料的選擇提供關鍵信息。本研究旨在表征新生、幼年或成年兔的脫細胞軟骨ECM，以及它們在21天體外培養和28天體內植入中對BMSCs軟骨分化和軟骨ECM合成的影響。據我們所知，這是第一項直接比較由不同年齡的軟骨組織制成的ECM支架的研究，以及不同年齡的去細胞化組織的內在特性如何影響ECM支架的特性，這進一步影響其軟骨生成性能，以實現成功的軟骨再生。我們的研究提出了幾個值得注意的發現，即由三種不同年齡的軟骨組織制成的ECM支架的軟骨生成作用。結果表明，3個不同年齡軟骨組織ECM支架的機械強度、sGAG和總膠原蛋白含量存在統計學差異，影響3個樣品的細胞增殖和分化。詳細的生化和基因分析表明，由較年輕的軟骨組織制成的ECM支架導致BMSCs更好的軟骨形成，但不幸的是，新生兒軟骨組織也會導致不需要的組織鈣化。

首先比較了新生（3天）、幼年（100天）和成年（200天）兔關節軟骨組織的成分和力學差異。結果發現，3天軟骨組織中的DNA和sGAG含量在統計學上高于100天和200天樣品[26，27]。sGAG是帶負電荷的多糖，可結合并保留水和水溶性分子[28]。因此，樣本的sGAG含量與其含水量相關，在3 d樣品中最高，并隨年齡增長呈下降趨勢[29]。相比之下，關節軟骨中的總膠原蛋白含量隨兔子年齡的增長而增加[30]。膠原蛋白是軟骨組織中結構的大分子，主要抵抗應激[31]。因此，軟骨組織的總膠原蛋白含量與機械強度一致，并隨年齡增長呈增加趨勢。去細胞化手術有效去除了不同年齡的所有軟骨組織中99%以上的dsDNA，并且dsDNA濃度均低于<50ng/mg干重的臨界脫細胞水平[10]。由于ECM中的sGAG通過弱分子間相互作用（例如非共價鍵）連接到膠原纖維網絡[32]，這在脫細胞過程中很容易中斷。因此，只有25-30%的sGAG在去細胞化后仍留在DCP中。相比之下，脫細胞后所有3個DCP的總膠原蛋白含量幾乎保持不變，表明去細胞化過程不會導致膠原網絡結構的降解或去除，并保留了軟骨組織的基本結構。這些結果也與之前的研究一致[9，33]。3種不同年齡軟骨組織的DCPs隨年齡增長呈下降趨勢，總膠原蛋白含量呈上升趨勢。經過相同的研磨過程，具有較高機械強度的軟骨組織導致軟骨組織顆粒的晶粒尺寸較大。因此，3 天 DCP 最小，200 天 DCP 的晶粒尺寸最大。雖然大小差異不影響去細胞化的有效性，但它可能會影響DCP上的細胞附著和行為[34]。

3個ECM支架，分別命名為膠原蛋白-3d、膠原蛋白-100d和膠原蛋白-200d水凝膠，由不同年齡的膠原蛋白水凝膠和不同年齡的不同DCP混合制成。SEM圖像表明，膠原蛋白網絡在所有樣品中都保存良好，單個DCP被困在膠原蛋白網絡中。因此，單個膠原蛋白-DCP水凝膠的力學強度受添加DCP的影響，3個水凝膠的儲存和損耗模量遵循膠原蛋白-200d>膠原蛋白-100d>膠原蛋白-3d的順序。當用BMSCs培養時，額外的DCPs在體外也延遲了水凝膠的降解并減少了其收縮，并且在體外和體內均顯示出BMSCs的軟骨分化和sGAG合成在體外和體內的年齡依賴性性能。膠原蛋白-3d水凝膠實現的軟骨形成最多，其次是膠原蛋白-100d，膠原蛋白-200d最少。這一發現證實了來自新生兒、幼年或成年兔的ECM支架會導致BMSCs產生不同的軟骨誘導性。這可能是由于許多因素的組合。首先，由于較年輕樣本中的sGAG濃度較高，更多的sGAG能夠在來自年輕兔子的ECM支架中保留。天然軟骨ECM富含GAG，主要由透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質鹽和硫酸乙酰肝素組成。到目前為止，許多研究已經證實了它們在調節軟骨形成方面的功能[35]，并且在生物材料中添加GAG可以促進干細胞的軟骨分化。因此，較年輕的DCP中較高的sGAG含量將有利于BMSC的軟骨形成。此外，由于年輕軟骨組織的機械強度較低，來自年輕兔的DCPs晶粒尺寸較小，在膠原蛋白-DCP復合水凝膠中的分散均勻。據報道，當與BMSC混合時，較小的ECM顆粒可以增強細胞-材料相互作用，并提高軟骨ECM衍生支架的誘導能力[36]。此外，水凝膠的力學性能也影響BMSCs的軟骨形成。 由于隨著兔齡的增長，DCPs的機械強度增加，膠原蛋白-DCP水凝膠的機械強度也隨之增加。卞等.[37]發現，與高交聯結構相比，機械強度較低的低交聯密度水凝膠更有利于軟骨基質的形成。然而，當利用BMSC在體外和體內進行軟骨再生時，組織鈣化是一個常見問題[38，39]。 在這項研究中，在膠原蛋白和膠原蛋白-3d樣品中發現了這個問題，可能是由于不同的原因。膠原蛋白水凝膠在體內的組織礦化是由于其快速降解特性導致細胞結構支撐的喪失，因此無法在新組織結構形成之前維持軟骨形成表型[40]。相比之下，膠原蛋白-3d的降解率遠低于膠原蛋白，幾乎與膠原蛋白-100d和膠原蛋白-200d相同。在這種情況下，膠原蛋白-3d誘導的組織鈣化可能是由于其內在特性。由于軟骨是骨骼生長的模板。胚胎階段為骨骼發育[41]，該階段的軟骨ECM也會影響培養細胞的發育并誘導BMSC的成骨。 因此，源自新生兒ECM的膠原蛋白-3d支架繼承了這一功能并導致再生基質的鈣化。相比之下，膠原蛋白-100d和膠原蛋白-200d支架來源于幼年和成人ECM，不再涉及軟骨內骨形成過程，也不利于BMSC的成骨分化。在這一發現的背景下，進一步比較發育生物學中不同年齡的軟骨組織之間的詳細組成和生物學差異將是有趣的。

結論

在這項研究中，收獲了來自新生兒、幼年和成年兔的關節軟骨組織并進行去細胞化。脫細胞前后3個陳年樣品的機械強度、sGAG和膠原蛋白含量差異均有統計學意義。因此，由不同年齡的不同DCP制成的復合水凝膠表現出年齡依賴性軟骨誘導性。一般來說，新生兒DCP促進BMSCs的軟骨形成最多，但導致嚴重的基質鈣化。相比之下，幼年和成年DCP的軟骨基質產生較少，但沒有觀察到可見的成骨作用。總之，它強調了在軟骨組織工程中使用天然軟骨組織制造ECM支架時年齡差異的重要性。盡管新生兒樣本具有最佳的成骨作用，但它也顯示出明顯的成骨作用，這將是限制其在軟骨再生中應用的關鍵缺點。相比之下，幼年樣本在促進BMSCs軟骨生成和抑制成骨方面取得了總體效果。因此，青少年ECM可能是比新生兒和成人ECM更好的來源。這些發現為我們目前在設計未來基于ECM的生物材料以成功修復關節軟骨方面的知識提供了重要信息。

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Piuma Nanoindenter是荷蘭Optics11公司出品的新型生物納米壓痕儀。主要應用范圍為生物組織、生物支架、水凝膠、聚合物、細胞等軟物質以及生物材料的機械性能研究。采用了新型探頭設計，彌補了傳統其他納米壓痕儀無法測試軟物質的問題也解決了原子力顯微鏡在軟物質測試中的數據波動大，操作困難、制樣嚴苛等常見問題。更開創性的在壓痕儀中加入了動態力學測試模式DMA，可以獲得材料與振動頻率相關的儲存模量、損失模量和損失因子，用于研究材料在交變力作用下的滯后現象和力學損耗。